生物安全柜如果使用不当，其防护作用就可能大大受到影响。
紫外灯--生物安全柜中不需要紫外灯。
如果使用紫外灯的话，应该每周进行清洁，以除去可能影响其杀菌效果的灰尘和污垢。
明火--在生物安全柜内所形成的几乎没有微生物的环境中，应避免使用明火。
溢出--实验室中要张贴如何处理溢出物的实验室操作规则，每一位使用实验室的成员都要阅读并理解这些规程。
认证--在安装时以及每隔一定时间以后，应由有资质的人员按照生产商的说明对每一台生物安全柜的运行性能以及完整性进行认证，以检查其是否符合国家及国际的性能标准。
清洁和消毒--由于剩余的培养基可能会使微生物生长繁殖；
因此在实验结束时，包括仪器设备在内的生物安全柜里的所有物品都应清除表面污染，并移出安全柜。
清除污染--生物安全柜在移动以及更换过滤器之前，必须清除污染。
个体防护装备--在使用生物安全柜时应穿着个体防护服。
警报器--可以在两种警报器中选择一种来装备生物安全柜。